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01.什么是基因融合

基因融合是指兩個(gè)基因的部分或全部序列相互融合為一個(gè)新的基因的過(guò)程。一定比例的融合基因會(huì )被轉錄成嵌合融合轉錄物，這些嵌合融合轉錄物可以通過(guò)保留其親本基因的閱讀框架形成融合蛋白，可以影響親本基因表達或作為長(cháng)的非編碼嵌合RNA發(fā)揮作用。

一般來(lái)說(shuō)，基因融合是指基因組層面的融合。但轉錄組層面也可能發(fā)生融合，主要是由于兩個(gè)不同基因轉錄產(chǎn)生的RNA，由于某種原因融合在了一起，形成新的融合RNA，該RNA可能編碼蛋白，也可能為非編碼。而基因組層面產(chǎn)生的融合基因，根據融合的情況，可能表達，也可能不表達（如破壞了啟動(dòng)子區域或其他原因）。

▲融合基因示意圖

02.融合基因的產(chǎn)生機制

由于染色體層的重排或轉錄過(guò)程中的錯誤剪接所造成的。在DNA層面上的重排主要包括了6種形式:

1. 染色體內的易位和染色體間的易位；

2. 大片段的插入；

3. 大片段缺失；

4. 串聯(lián)重復；

5. 倒置；

6. 染色體碎裂導致的復雜重排。

 ▲DNA層面上的重排形式

在RNA層面上，轉錄過(guò)程中的“通讀事件”也可能產(chǎn)生融合蛋白。當RNA聚合酶不能正確終止一個(gè)基因末端的轉錄，并且由于異常剪接而繼續轉錄到下一個(gè)基因末端時(shí)，產(chǎn)生了嵌合轉錄子稱(chēng)之為“通讀事件”，并不涉及基因組物質(zhì)的重排(DNA重排)即可產(chǎn)生融合轉錄子。

 ▲轉錄過(guò)程中的“通讀事件”

03.融合基因常見(jiàn)檢測方法

FISH

通過(guò)熒光標記的探針與細胞核內的DNA 靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀(guān)察分析基因擴增或融合變異的一種分子檢測技術(shù)，一般被認為是檢測基因擴增和融合的“金標準”，但也存在一定的局限性。如并非所有檢測到的融合均會(huì )產(chǎn)生可表達的融合RNA，分離探針可能會(huì )遺漏較小的染色體內重排導致假陰性結果，無(wú)法確定和區分不同的融合基因變異亞型等。

IHC

利用抗原抗體反應和化學(xué)顯色原理，檢測組織或細胞學(xué)切片中特定蛋白表達的技術(shù)。IHC檢測靈敏度高、成本低、檢測時(shí)間短、易于自動(dòng)化，但其準確性取決于檢測的融合蛋白是否有經(jīng)過(guò)驗證的抗體，如VentanaD5F3 IHC檢測肺腺癌患者ALK 融合的準確性高，而 ROS1和NTRK陽(yáng)性IHC結果尚需其他檢測方法驗證。

RT-PCR

在RNA水平檢測融合RNA，靈敏度高、檢測時(shí)間短，但僅限于檢測引物設計范圍內的已知融合，無(wú)法檢出未知融合。此外，該方法檢測結果的準確性高度依賴(lài)標本RNA的質(zhì)量。

靶向二代測序

通過(guò)大規模平行測序的方法，對引物或探針設計范圍內的區域同時(shí)進(jìn)行多個(gè)融合基因檢測。根據核酸投入物的不同，靶向二代測序可在DNA或RNA水平檢測基因融合。

根據中心法則，以DNA為模板通過(guò)轉錄和剪接加工產(chǎn)生成熟的RNA。在DNA水平上，融合斷點(diǎn)位置通常發(fā)生在較長(cháng)的內含子區域，且融合的斷裂點(diǎn)不同患者可能不同，故用傳統的PCR直接擴增斷裂點(diǎn)是不易實(shí)現的，采用NGS的方法設計探針去抓取斷裂點(diǎn)是一種可行的檢測方法，但從DNA水平檢測融合基因不可避免存在如下局限性和挑戰：

1.融合基因的斷點(diǎn)一般在內含子區域，而融合基因的內含子又特別冗長(cháng)，因此，如果基于DNA-based的檢測方法就要在內含子區域鋪設大量的探針，探針設計難度大。

2.大量探針也會(huì )導致下機數據量過(guò)大（增加實(shí)驗成本，加大生信分析難度）。

3.大量探針仍會(huì )存在覆蓋盲點(diǎn)，導致融合漏檢。

4.DNA層面出現融合不一定能轉錄成mRNA進(jìn)而翻譯成蛋白質(zhì)，進(jìn)而不能激活下游MAPK/mTOR通路，而RNA則相對更接近翻譯成為蛋白質(zhì)。

相比DNA水平，RNA水平上融合基因表現為前后兩個(gè)基因外顯子之間的銜接，融合點(diǎn)相對固定。這一特征為精準設計探針或引物提供了先天優(yōu)勢。因此，根據融合基因序列特點(diǎn)，在RNA水平上檢測融合基因比DNA水平更易實(shí)現。

 ▲融合基因常見(jiàn)的檢測方法

04.融合基因檢測：DNA vs RNA

DNA-based NGS

原理：對可能發(fā)生融合的區域設計探針進(jìn)行覆蓋，雜交捕獲得到目的片段進(jìn)行測序分析。

通過(guò)雜交捕獲建庫，僅使用DNA就可同時(shí)對多個(gè)腫瘤相關(guān)基因的突變、擴增、融合及腫瘤突變負荷（TMB）、微衛星不穩定狀態(tài)進(jìn)行檢測，極大地節約了標本量，并且能夠在DNA水平確定基因融合的斷點(diǎn)位置和融合伴侶，檢出已知和未知的基因融合。DNA-based NGS測序是基于腫瘤細胞來(lái)源的DNA分子進(jìn)行檢測。DNA分子由螺旋的雙鏈組成，相對于RNA更加穩定。因此，DNA-based NGS的組織學(xué)/細胞學(xué)樣本，包括新鮮組織、FFPE、胸水等，均可滿(mǎn)足檢測質(zhì)控要求。在組織樣本難以獲取或樣本量不足時(shí)，還可以通過(guò)液體活檢提取ctDNA進(jìn)行測序，而這是RNA-based NGS無(wú)法實(shí)現的。但是，DNA二代測序檢測基因融合受腫瘤細胞含量、標本DNA質(zhì)量、捕獲探針覆蓋度及DNA層面復雜基因變異等影響，可能會(huì )出現漏檢。另外，隨著(zhù)DNA二代測序在臨床分子檢測中的廣泛應用，越來(lái)越多攜帶罕見(jiàn)伴侶的激酶融合被發(fā)現，但某些罕見(jiàn)融合并不能產(chǎn)生有功能的融合RNA/蛋白。

RNA-based NGS

RNA二代測序可以通過(guò)多重PCR擴增、錨定多重PCR或雜交捕獲建庫在RNA水平檢測融合轉錄本。與DNA二代測序需要對外顯子和內含子區均進(jìn)行探針捕獲相比，RNA測序僅需要針對外顯子區設計引物或探針，相對簡(jiǎn)單、經(jīng)濟，不受DNA層面復雜融合的影響，且RNA二代測序能直接真實(shí)地反映轉錄水平融合的表達情況及融合伴侶基因類(lèi)型。

但是，RNA-based NGS檢測樣本要求相對較高。從樣本質(zhì)量上講，由于存在核糖核酸酶且RNA是單鏈結構，非常容易降解，因此，新鮮組織是做RNA-based NGS檢測的******。有研究表明，高達50%的存檔FFPE樣本，特別是較舊的樣本，不能滿(mǎn)足RNA建庫和測序的要求，可能無(wú)法通過(guò)測序前的質(zhì)量控制。目前尚不推薦從液體活檢樣本中提取RNA進(jìn)行腫瘤融合基因檢測，這也限制了RNA-based NGS檢測的應用。

紐約紀念斯隆凱特琳癌癥研究中心（MSKCC）的一項真實(shí)世界肺腺癌大隊列研究和一項中國人群的研究中均通過(guò)RNA-based NGS在DNA NGS檢測陰性的非小細胞肺癌樣本中檢出了10%左右的靶點(diǎn)基因融合或MET跳突，相比DNA水平，RNA水平上融合基因表現為前后兩個(gè)基因外顯子之間的銜接，不受內含子的影響，融合點(diǎn)相對固定，這一特征為精準設計探針或引物提供了先天優(yōu)勢，也是RNA-based NGS比DNA-based NGS檢測融合基因更具優(yōu)勢的原因之一。

 ▲紐約紀念斯隆凱特琳癌癥研究中心研究

 ▲中國人群研究

 ▲NGS檢測基因融合對比

05.總結

相比DNA-based NGS，RNA-based NGS不受內含子影響，可提升融合基因的檢出率。融合基因DNA和RNA水平上的結構特征決定了融合基因檢測，RNA水平遠比DNA水平更敏感，更準確，但是樣本要求較高。

DNA-based NGS對樣本要求相對較低，可聯(lián)合其他biomarker共同檢測，同時(shí)DNA層面可檢出的罕見(jiàn)融合伴侶、外顯子斷點(diǎn)融合及基因間融合，但需在RNA或蛋白水平進(jìn)一步驗證。

在臨床應用中，全面準確地腫瘤靶基因檢測需要臨床實(shí)踐經(jīng)驗的積累以及不斷的總結驗證。基于檢測方法學(xué)的局限性和檢測標本的復雜性，多平臺聯(lián)合應用或補充有益于腫瘤患者的精準診治。

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